Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

 DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer).  Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya.  Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.

Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer.  Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks.  Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia.  Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA.

 DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya.    Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6.

Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan.  Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah.  Mereka tampak ‘smear’.  Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA.

 Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks.  Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat.  Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan.  ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat.  Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat.

Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 1).

  1. Kloning DNA

 Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA.  Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector.  Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain.  Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.

 Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

 Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

sumber :

http://blog.umy.ac.id/teknologiku/escape-legacy-3d-apk/