Kloning DNA dalam plasmid vektor

 Kloning DNA dalam plasmid vektor

 Kloning DNA dalam plasmid vektor

 Kloning DNA dalam plasmid vektor

 DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak.  Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1.      Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA   bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2.      Mengandung marker selektif yang menyebabkan sel yang membawa vektor (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi.
3.      Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi.  Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector  sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid.  Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.  Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah.  Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI.  Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 1).
b. Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
 Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan.  Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik.  E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium.   Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid – sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
c.  Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
 Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda.  Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan.  Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase.  DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase.  Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 2).
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber.  Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library.  cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA.  Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9).  Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda  yang disebut cDNA (copy DNA).
 Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic.  cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vektor.
sumber :